Hoch

May 25, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7241 (2022) Diesen Artikel zitieren

4349 Zugriffe

3 Zitate

104 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Der Klebsiella-Jumbo-Myophage ϕKp24 weist eine ungewöhnlich komplexe Anordnung von Schwanzfasern auf, die mit einer Wirtszelle interagieren. In dieser Studie kombinieren wir Methoden der Kryo-Elektronenmikroskopie, Methoden zur Vorhersage der Proteinstruktur, molekulare Simulationen, mikrobiologische und maschinelle Lernansätze, um das Kapsid, den Schwanz und die Schwanzfasern von ϕKp24 zu untersuchen. Wir bestimmen die Struktur des Kapsids und des Schwanzes mit einer Auflösung von 4,1 Å und 3,0 Å. Wir beobachten, dass sich die Schwanzfasern bei der Anheftung an die Zelloberfläche verzweigen und dramatisch neu anordnen. Diese komplexe Konfiguration umfasst vierzehn mutmaßliche Schwanzfasern mit Depolymeraseaktivität, die ϕKp24 die Fähigkeit verleihen, eine breite Palette von Kapselpolysaccharid (CPS)-Typen von Klebsiella pneumoniae zu infizieren. Unsere Studie liefert strukturelle und funktionelle Einblicke in die Art und Weise, wie sich ϕKp24 an die variablen Oberflächen von eingekapselten bakteriellen Krankheitserregern anpasst, was für die Entwicklung von Phagentherapieansätzen gegen pan-resistente K. pneumoniae-Stämme nützlich ist.

Krankheitserregende Bakterien stellen eine immer größere Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Während viele bakterielle Infektionen durch Antibiotika wirksam geheilt werden können, führen antimikrobielle Resistenzen (AMR) zunehmend zu unwirksamen Behandlungen. Eine aktuelle Studie berichtete über 3,57 Millionen Todesfälle im Zusammenhang mit AMR bei sechs führenden Krankheitserregern im Jahr 20191. Darunter ist Klebsiella pneumoniae, ein Krankheitserreger, der von der Weltgesundheitsorganisation als Priorität 1 (kritisch) für die Entwicklung neuer Antibiotika anerkannt wird2. K. pneumoniae kann beim Menschen Lungenentzündung, Harnwegsinfektionen, Bakteriämie und andere Infektionskrankheiten verursachen, insbesondere bei Personen mit geschwächtem Immunsystem3. Die überwiegende Mehrheit der klinischen Isolate von K. pneumoniae exprimiert eine ausgeprägte Kapsel, die allgemein als wichtiger Virulenzfaktor angesehen wird, der den Schutz vor dem Immunsystem des Wirts vermittelt4. Es gibt über hundert genetisch unterschiedliche Kapsellocus-Typen, von denen 77 gut charakterisierte chemische Strukturen bei der Serotypisierung verwendet werden (K-Typen)5.

Obwohl multiresistente K. pneumoniae unempfindlich gegenüber Standardantibiotika sind, bleiben sie anfällig für Bakteriophageninfektionen. Bakteriophagen, kurz Phagen, sind Viren, die Bakterien infizieren. Klebsiella-spezifische Phagen können ihren natürlichen Wirt erfolgreich infizieren und töten; Allerdings sind die meisten dieser Phagen aufgrund der variablen Kapselpolysaccharide (CPS) dieser Art, die als primärer Phagenrezeptor fungieren, typischerweise hoch stammspezifisch. Kapselabhängige Klebsiella-Phagen, einschließlich der Phagen ΦK64-1 oder vB_KleM-RaK26,7, sind mit Schwanzfasern oder Schwanzspitzen ausgestattet, die als rezeptorbindende Proteine ​​(RBPs) dienen und CPS-abbauende Enzymdomänen (geprägte Kapseldepolymerasen) enthalten, die eine erfolgreiche Phagenadsorption ermöglichen und Infektion8. Der Einfachheit halber verwenden wir im Folgenden den Begriff „Schwanzfaser“.

Schwanzbakteriophagen mit Genomen von >200 kbp DNA werden als Jumbophagen9 definiert. Die bemerkenswertesten Strukturmerkmale von Jumbo-Phagen sind große Kapside, die ihr Genom einkapseln10. Der kürzlich beschriebene Jumbo-Myophage vB_KpM_FBKp24 (ϕKp24) kodiert für mindestens neun Schwanzfasern, die unterschiedliche Depolymerasedomänen enthalten, was auf ein erweitertes Wirtsspektrum schließen lässt. Die Genomanalyse ergab, dass ϕKp24 nur sehr begrenzte Ähnlichkeit mit allen anderen bekannten Phagen11 aufweist und daher eine neue Familie mit der Bezeichnung Vanleeuwenhoekviridae darstellt (ICTV-Klassifizierung in Bearbeitung). Darüber hinaus zeigte die Transmissionselektronenmikroskopie eine einzigartige komplexe Struktur von Schwanzfasern an der Grundplatte. Allerdings fehlen derzeit detailliertere Einblicke in die Struktur und Funktion dieses einzigartigen Schwanzfasersatzes.

Um einen Einblick in die ungewöhnliche Struktur von ϕKp24 zu erhalten, haben wir sein Kapsid, seinen Schwanz und seine Schwanzfasern mit verschiedenen Strukturmethoden analysiert. Wir haben Atommodelle für das hochgeordnete Phagenkapsid und den Schwanz mithilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), der Einzelpartikelanalyse (SPA) in Kombination mit AlphaFold212-Proteinstrukturvorhersagen und Molekulardynamiksimulationen (MD) erstellt. Die Daten enthüllten ungewöhnliche Merkmale des Kapsids von ϕKp24, insbesondere die Zusammensetzung des gesamten Kapsids durch ein einzelnes MCP und das Vorhandensein einer Pore in der Mitte der Sechsecke. Mithilfe der Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) erhielten wir Einblick in die Struktur der flexiblen und ungeordneten Schwanzfasern. Diese Analyse wurde durch Ansätze des maschinellen Lernens unterstützt, um ein neuronales Netzwerk so zu trainieren, dass es die komplexen Schwanzfasern für die quantitative Analyse der Tomographiedaten automatisch verfolgt. Unsere Analyse ergab eine deutliche Neuordnung der Schwanzfasern während des Infektionsprozesses. Darüber hinaus haben wir die Infektiosität von ϕKp24 anhand einer K-Serotyp-Sammlung von K. pneumoniae-Stämmen getestet und dabei die ungewöhnlich breite Palette an CPS-Typen gezeigt, auf die die Schwanzfasern abzielen.

Die Vorhersage der Aminosäuresequenz und Bindungstests gegen eine Klebsiella-Serotypenbibliothek in Kombination mit einer Struktur-Funktions-Analyse der Schwanzfasern lieferten Einblicke in ihre hyperverzweigte komplexe Organisation. Die Kombination von Struktur-, Computer- und Labortechniken ermöglichte es uns, detaillierte Einblicke in die Struktur und Funktion dieses besonderen Bakteriophagen zu gewinnen.

Um die Struktur des ϕKp24-Kapsids zu untersuchen, haben wir den Phagen mithilfe von Kryo-EM abgebildet (Ergänzungsabbildung 1a, Datenerfassungsparameter in Ergänzungstabelle. 1). In unserem Datensatz finden wir drei Varianten des Kapsids: mit DNA gefüllte volle Kapside, leere Kapside und teilweise mit DNA gefüllte Kapside. Wir haben die vollständigen (EMD-14356, ergänzende Abb. 1b, Cyan) und leeren (EMD-13862, Abb. 1a) Kapsidstrukturen von ϕKp24 mit Relion13 auf 4,3 Å bzw. 4,1 Å Auflösung nach Polieren bzw. Ewald-Kugelkorrektur rekonstruiert. unter Verwendung des „Goldstandard“-Kriteriums FSC0.14314 (ergänzende Abbildung 2b, c). Da sich die Rekonstruktionen des leeren und des vollen Kapsids gut überlagern (ergänzende Abbildung 1d), haben wir unsere Analyse auf die Rekonstruktion des leeren Kapsids mit höherer Auflösung (4, 1 Å) konzentriert. Das leere Kapsid (Abb. 1a) hat einen Durchmesser von 145 nm von Scheitelpunkt zu Scheitelpunkt, 130 nm entlang der zweizähligen Symmetrieachse und folgt einem T = 27 (h = 3; k = 3; T = h2 + k2 + hk). Triangulationssymmetrie mit planarem Umriss. (Abb. 1b).

a Das dsDNA-leere Kapsid (EMD-13862) des Phagen ϕKp24 wurde mit einer Auflösung von 4,1 Å unter Verwendung von 19.193 Partikeln rekonstruiert. Die angezeigte Struktur wird basierend auf dem Abstand vom Kapsidzentrum mithilfe des Farbbalkens unten rechts radial eingefärbt. b Schematische Darstellung der ϕKp24-Kapsidorganisation. Das Kapsid folgt einer T = 27-Symmetrie. Die h- und k-Volumina in der Triangulationssymmetrieberechnung werden rot hervorgehoben (https://viralzone.expasy.org/8577). c Organisation eines Hexamers. Ein Hexamer kann mit anderen Hexameren oder einem Pentamer über Arme (blau) oder Hände (orange) interagieren, die wahrscheinlich eine stabilisierende Funktion haben, ähnlich wie Dekorationsproteine, die in anderen Phagenstrukturen vorhanden sind. d Banddiagramm von gp372 aus dem Phagen ϕKp24, erzeugt durch AlphaFold2. Das Modell besteht aus drei Teilen, die entsprechend dem Monomer eines Hexamers in c gefärbt sind. Das rechte Feld zeigt gp372, eingepasst in die Dichtekarte. e Draufsicht auf ein hexameres Kapsomer. Die sechs Monomere sind einzeln eingefärbt. In der Mitte des Hexamers wird eine Pore gebildet, die aus sechs langen C-terminalen Schleifen besteht, die miteinander verdreht sind (vergrößerter rechteckiger Kasten, rechts oben). Das rechte untere Feld zeigt die Pore nach Drehung des oberen Bildes um 90°. f Zwei Hexamere mit hervorgehobenen Wechselwirkungen zwischen den Kapsomeren. Zwei gp372-Handregionen interagieren miteinander über eine große Ansammlung geladener Reste, darunter E201, K210, K247, D249, E251, D260 und R264 (vergrößerter rechteckiger Kasten, oberes Feld). Die dreieckigen MCP-Körper innerhalb desselben Hexamers interagieren über komplementäre Salzbrücken zwischen den Resten R477 und E442 des Nachbarn im Uhrzeigersinn und den Resten R583 und D419 und D587 des Nachbarn im Uhrzeigersinn (vergrößerter rechteckiger Kasten, untere linke Tafel). Der dreieckige Körper interagiert auch über eine Reihe von Salzbrücken mit der Handregion, darunter K380/E220, E398/R190, R554/E313 und R558/D163 (vergrößerter rechteckiger Kasten, Bild unten rechts). Wasserstoffbrückenbindungen wurden mit ChimeraX mit entspannten Abstands- und Winkelkriterien (0,4 Å bzw. 20° Toleranz) analysiert. g Seitenansicht der Hexamer-Hexamer-Wechselwirkungen nach Drehung des oberen Bildes um 90°.

Das Kapsid des Pseudomonas aeruginosa Jumbo-Phagen phiKZ15 und der Ralstonia solanacearum-Phagen ϕRSL116 und ϕRSL217 werden in der HK97-Faltung18,19 mit einer Triangulationszahl von T = 27 aufgebaut. Ähnlich wie diese Phagenkapside wird das Kapsid von ϕKp24 durch aufgebaut ein Gitter aus Hexameren und Pentameren in jeder Facette (Abb. 1b). Die Hexamere und Pentamere von ϕKp24 bestehen aus Kopien desselben Hauptkapsidproteins (MCP, gp372, Zugangsnummer QQV92002). Das Kapsid enthält insgesamt 260 Hexamere (dunkelgrün, 13 pro Facette) und 11 Pentamere (türkis, eine Ecke wird vom Portalkomplex besetzt), die 1615 Kopien des MCP darstellen (Ergänzungsfilm 1). Die MCPs werden zu einer ikosaedrischen Hülle zusammengesetzt, die das Phagengenom umschließt. Im Fall von ϕKp24 beträgt der vorhergesagte MCP gp372 (Abb. 1d, links).

Gp372 enthält 597 Aminosäuren und ist unseres Wissens nach das größte MCP, das derzeit in einem Phagen beschrieben wird. Seine Struktur wurde mit AlphaFold212 vorhergesagt und modelliert (Abb. 1d, links). Es besteht aus drei Hauptteilen: einem „dreieckigen Körper“ (Abb. 1c, graues Dreieck und Abb. 1d, gepunkteter Kasten, Reste 28–88, 314–597); ein „Arm“ (Abb. 1c, blaues Oval, und Abb. 1d, blau, Reste 89–166); und eine „Hand“ (Abb. 1c, orangefarbenes Oval und Abb. 1d, orange, Reste 167–313).

Während der dreieckige Körper von MCP gp372 auf Sequenzebene keine Ähnlichkeit mit dem MCP gp5 des Phagen HK9720,21 aufweist, weisen sie eine gewisse strukturelle Ähnlichkeit auf. Es gibt jedoch einige bemerkenswerte Unterschiede zwischen dem MCP von ϕKp24 und HK97. Gp372 von ϕKp24 enthält eine lange C-terminale Schleife (eine Komponente der Pore), die in HK97 fehlt. Darüber hinaus sind die N-terminalen und C-terminalen Domänen unterschiedlich gefaltet: (1) Die A-Domäne des HK97-gp5-Monomers weist vier zentrale, meist antiparallele β-Faltblätter und zwei Helices20 auf. Im Gegensatz dazu gibt es in der entsprechenden Domäne von gp372 (C-terminale Domäne) fünf antiparallele β-Faltblätter und vier Helices unterschiedlicher Länge; (2) Der N-terminale Arm des HK97-gp5-Monomers liegt in einer größtenteils unstrukturierten Konformation vor, während sich der N-terminale Arm von gp372 als lange Helix faltet (Ergänzende Abbildungen 5, 6). Der Arm besteht aus zwei kurzen antiparallelen β-Faltblättern, drei kurzen Helices und einem kurzen β-Faltblatt nahe der „Hand“. Das hervorstechendste Merkmal der Hand sind zwei Schichten von β-Faltblättern, wobei jede Schicht drei antiparallele β-Faltblätter enthält. Zusätzlich gibt es zwei kurze Helices an der Spitze der „Hand“.

Um die gp372-Struktur gemäß unseren 3D-Kryo-EM-Daten weiter zu verfeinern und mutmaßliche Wechselwirkungen zwischen MCPs in der nativen Kapsidanordnung zu bestimmen, haben wir als Nächstes Modelle der Kapsid-Hexamer- und Pentamer-Anordnungen rekonstruiert, einschließlich der nächstgelegenen benachbarten Hexamere (ergänzende Abbildung 9). wie im Abschnitt „Methoden“ ausführlich beschrieben. Kurz gesagt, Modelle der Hexamer- und Pentamer-Anordnungen wurden zunächst durch starres Andocken der vorhergesagten gp372-Struktur erstellt und anschließend mithilfe der Molekulardynamik-Flexiblen-Anpassung (MDFF)22 auf unsere 4,1-Å-Karte verfeinert. Das resultierende Hexamer-Modell wurde dann starr an die entsprechenden Regionen rund um die verfeinerten Pentamer- und Hexamer-Anordnungen angedockt und die kombinierten Strukturen einer zusätzlichen MDFF-Simulation unterzogen. Die erhaltenen Modelle liefern daher repräsentative Informationen zu jeder einzelnen MCP-MCP-Wechselwirkung innerhalb des Kapsids und ermöglichen eine Bewertung der wichtigsten Wechselwirkungen zwischen Resten, die wahrscheinlich für die Kapsidstabilität von entscheidender Bedeutung sind.

Nach der Analyse der Inter-MCP-Kontakte des Hexamers haben wir eine Liste mutmaßlicher starker Wechselwirkungen zusammengestellt (ergänzende Abbildung 9). Der dreieckige Körper der MCPs interagiert hauptsächlich mit den dreieckigen Körpern der MCPs, die direkt benachbart und innerhalb desselben Hexamers liegen (Abb. 1f). Zu diesen Wechselwirkungen gehört eine Reihe komplementärer Salzbrücken zwischen den Resten R477 und E442 am Nachbarn im Uhrzeigersinn sowie dem Rest R583 und D419 und D587 am Nachbarn im Uhrzeigersinn. Der dreieckige Körper interagiert auch stark mit der Handregion seines Nachbarn im Uhrzeigersinn über eine Reihe von Salzbrücken (Abb. 1f), darunter K380/E220, E398/R190, R554/E313 und R558/D163. Zusätzlich zu diesen Wechselwirkungen zwischen MCPs innerhalb desselben Hexamers vermittelt die Handregion auch starke Wechselwirkungen mit der Handregion eines MCP aus einem benachbarten Hexamer (Abb. 1f). Dabei handelt es sich um eine große Ansammlung geladener Reste, darunter E201, K210, K247, D249, E251, D260 und R264, die komplementäre Wechselwirkungen eingehen. Die Gesamtkonformationen der zentralen und umgebenden Hexamere sind ziemlich ähnlich und weisen eine quadratische Mittelwertverschiebung (RMSD) des Rückgrats von ~1,5 Å auf. Schließlich wies das MCP von ϕKp24 im Vergleich zu anderen bekannten Phagenkapsidstrukturen23,24 ein Strukturmerkmal auf, über das unseres Wissens noch nicht berichtet wurde: Jede der sechs langen C-terminalen Schleifen (Reste Q582–S597) ist an der beteiligt Bildung einer zentralen helikalen Pore mit einem Außendurchmesser von ~2 nm (Abb. 1e, rechte obere und untere Tafel). Die Analyse der Elektrostatik entlang der Pore (ergänzende Abbildung 10) zeigt, dass sie in der Nähe des Eingangs (von außen in das innere Kapsid) hydrophil ist, während sie auf der gegenüberliegenden Seite lipophil ist. Darüber hinaus enthält es nahe der Porenmitte einen ringförmigen Abschnitt, der negativ geladen ist.

Jedes Pentamer besteht aus fünf MCP-Monomeren (Abb. 2a). Im Vergleich zu einem gp372 in einem Hexamer zeigt der N-Terminus im gp372 des Pentamers eine andere Faltungsrichtung (Abb. 2b, linkes Feld). Darüber hinaus verändert gp372 in einem Pentamer die relative Ausrichtung des dreieckigen Körpers und der Hand im Vergleich zum MCP in einem Sechseck, wodurch gp372 in einem Pentamer stärker gebogen wird. (Abb. 2b, rechtes Feld). Ein Vergleich der das Pentamer umgebenden Hexamere mit denen aus der hexametrischen Anordnung zeigt, dass sie auch etwas stärker gekrümmt sind und einen RMSD von 3–5 Å aufweisen.

a Draufsicht auf ein pentameres Kapsomer. Fünf gp372-Strukturen wurden in die Dichtekarte eingepasst und unterschiedlich eingefärbt. Im Vergleich zum Hexamer fehlt dem Pentamer eine strukturierte Pore in der Mitte. Jede C-terminale Schleife ist flexibel und neigt dazu, sich in den Bereich zu bewegen, der näher an der Hand eines anderen gp372 liegt. b Strukturvergleich zwischen MCP (Cyan) in einem Hexamer und MCP (Grau) in einem Pentamer. Es gibt einige Unterschiede, wie die C-terminale Schleife, die N-terminale α-Helix und den Pendelwinkel (oberer roter Pfeil) zweier dreieckiger Körper (ausgerichtete Hand und Arm) oder den Pendelwinkel (unterer roter Pfeil) von zwei Hände (ausgerichteter dreieckiger Körper). Das rechte Bild in b zeigt den Vergleich nach Drehung der linken Struktur um 90°. c Pentamer-Hexamer-Wechselwirkungen. Die Wechselwirkungen zwischen einem Pentamer (grau) und einem benachbarten Hexamer (cyan) ähneln den Wechselwirkungen zwischen zwei Hexameren. Das obere linke Feld zeigt, dass die Hand (grau) des Nachbarn im Uhrzeigersinn (CW) mit dem dreieckigen Körper (lila) im selben Pentamer über Salzbrücken (Rest E220 und K380, E163 und R558) interagieren kann. Im Pentamer-MCP interagieren die Reste R501 und R583 im dreieckigen Körper mit den Resten D448 und E442 (der vergrößerte rechteckige Kasten, obere rechte Tafel). Das gp372 aus einem Hexamer und das gp372 aus einem Pentamer werden je nach Struktureinheit durch unterschiedliche Farben hervorgehoben. Der dreieckige Körper, Arm und die Hand des gp372 in Hexamer sind schwarz, tiefblau und orange gefärbt. Der dreieckige Körper, Arm und die Hand des gp372 im Pentamer sind lila, grün und rosa gefärbt. d Seitenansicht der Pentamer-Hexamer-Wechselwirkungen nach Drehung des oberen Bildes um 90°.

Insgesamt ähneln die MCP-Interaktionsregionen in einem Pentamer denen im Hexamer (Abb. 1f, ergänzende Abb. 9). Die stärkere Krümmung des Pentamers (Abb. 1g, 2d) verändert jedoch die relative Ausrichtung zwischen dem dreieckigen Körper und den Handregionen, was zu unterschiedlichen stabilisierenden Kontakten führt. Insbesondere interagieren im Pentamer-MCP die Reste R501 und R583 im dreieckigen Körper mit den Resten D448 bzw. E442 im dreieckigen Körper des Nachbarn im Uhrzeigersinn. Die Wechselwirkungen mit der Region im Uhrzeigersinn sind insgesamt reduziert, wobei die Reste K380 und R558 mit den Resten E220 bzw. D163 interagieren. Darüber hinaus spielt die Handregion im Pentamer-MCP, wie im Hexamer-MCP zu sehen ist, eine analoge Rolle bei der Vermittlung von Hand-Hand-Wechselwirkungen mit einem benachbarten Hexamer über einen oben beschriebenen geladenen Restrestfleck. Im Gegensatz zur Hexamer-Anordnung scheinen die C-terminalen Schleifen im Pentamer in der Dichtekarte keine große, wohldefinierte Pore zu bilden. Stattdessen sind sie ungeordnet, möglicherweise aufgrund dieser unterschiedlichen Anordnung aufgrund des verringerten Raums und der größeren sterischen Hinderung zwischen den MCPs in dieser Region (Abb. 2a). Dennoch beobachten wir eine kleine Öffnung im Zentrum des Pentamers, die möglicherweise für den Lösungsmitteltransport geeignet ist.

Für die helikale Rekonstruktion des Schwanzes wurden 450-Pixel-Segmente von Phagen ausgewählt, die vollständige Kapside enthielten. Nach der Klassifizierung, dem Polieren und der 3D-Verfeinerung wurde die Schwanzstruktur (EMD-14357, Abb. 3a) in ihrer erweiterten Konformation mit einer Auflösung von 3,0 Å in Relion13 bestimmt (ergänzende Abb. 11b). Die Länge des verlängerten Schwanzes beträgt durchschnittlich 180 nm (gemessen in 2D-Mikroaufnahmen, vom Kragen bis zur Spitze der Spitze). Basierend auf der Dichtekarte beträgt der Durchmesser des Schwanzes 24,5 nm und die Länge des Hüllenmonomers über die längste Achse beträgt 11 nm (Abb. 3a). Wie bei anderen beschriebenen kontraktilen Auswurfsystemen und Bakteriophagenschwänzen ist die kontraktile Schwanzhülle von ϕKp24 um das Innenrohr herum angeordnet. Die Hülle und das Innenrohr folgen der gleichen Spiralsymmetrie mit einer zusätzlichen 6-fachen Symmetrie um die Schwanzachse. Die Dicke eines hexameren Rings beträgt 4 nm. Mit HI3D25 werden der Helixanstieg und die Spiraldrehung bei 39,03 Å bzw. 20,89° bestimmt.

a Draufsicht (oberes Bild) und Seitenansicht (unteres Bild) Ausrichtung der 3D-Struktur (EMD-14357) des 3,0 Å helikalen Schwanzes. Jeder der sechs helikalen Stränge ist unterschiedlich gefärbt. b Modell des aus Alphafold2 generierten Schwanzscheidenproteins gp118. Das Hüllprotein gp118 und das innere Röhrenprotein gp119 wurden in einen Ring der ϕKp24-EM-Karte eingepasst (oberes Bild, Draufsicht; unteres Bild, Seitenansicht). Im unteren Bereich ist das Mantelmonomer (blau) dargestellt, das aus der unteren Schicht stammt, um die Ring-Ring-Wechselwirkungen sichtbar zu machen. Kontakte zwischen drei Mantelmonomeren werden von zwei aufeinanderfolgenden Ringen hervorgehoben (der vergrößerte rechteckige Kasten, unteres rechtes Feld). c Banddiagramm des vorhergesagten AlphaFold2-Modells des ϕKp24-Hüllenmonomers, gp118. Das Modell besteht aus zwei Teilen: der zentralen Hülle (gepunkteter Kasten, orange und dunkelblau) und einer verlängerten äußeren Hüllenkomponente (hellblau). Das untere Bild ist gegenüber dem oberen Bild um 90° gedreht, um die N-terminale Verlängerung zu zeigen. d Schematische Darstellung der ϕKp24-Hüllenorganisation. Der Grat, an dem die drei Mantelmonomere aus zwei Schichten interagieren, ist in einem Kreis dargestellt.

Die Struktur des Hüllproteins (gp118, Zugangsnummer QQV92013.1) wurde mit AlphaFold2 vorhergesagt und mit ISOLDE26 in ChimeraX27 in die ϕKp24-Schwanz-EM-Karte eingepasst (Abb. 3b). Das Hüllenprotein voller Länge besteht aus äußeren und zentralen Hüllenkomponenten. Die äußere Mantelkomponente (Abb. 3c, hellblau) befindet sich an der Spitze des Mantelmonomers und zeigt nach außen. Die Sequenzanalyse durch ENDscript328 zeigt, dass die äußere Hüllenkomponente ein Homolog des Schwanzhüllenproteins gp29PR (PDB-ID: 3SPE) aus dem Bakteriophagen phiKZ ist (ergänzende Abbildung 15). Diese äußere Hüllenkomponente ist nicht an den Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten während des Zusammenbaus beteiligt29. In der kontrahierten Konformation können die äußeren Mantelkomponenten zweier Schichten durch elektrostatische Kräfte miteinander interagieren. Dies ist wahrscheinlich, da die nach oben gerichteten Oberflächen der äußeren Hüllenkomponenten einen negativ geladenen Fleck enthalten, während die nach unten gerichteten Oberflächen einen positiv geladenen Fleck aufweisen (ergänzende Abbildung 18).

Die zentrale Hüllenkomponente (Abb. 3c, orange und dunkelblau) besteht aus der C-terminalen Domäne, der N-terminalen Domäne und zwei langen Verlängerungen. Die zentrale Hülle ist für den Aufbau und die Kontraktion der Hülle von entscheidender Bedeutung. Um die Wechselwirkungen zwischen Schwanzhüllenproteinen im Schwanz zu erleichtern, können die beiden langen Verlängerungen der zentralen Hülle (die N-terminale Verlängerung, Reste M1–S21; die C-terminale Verlängerung, Reste A667–G689) mit dem C-Terminus verbunden werden Domänen zweier benachbarter gp118-Proteine, die sich im Ring unten befinden (Abb. 3d). Darüber hinaus kann sich die C-terminale Domäne mit zwei benachbarten Hüllproteinen verbinden, die sich im oberen Ring befinden (Abb. 3b, unteres rechtes Feld). Dabei verbinden sich drei Hüllproteine ​​aus zwei unterschiedlichen Schichten zu einem sogenannten Grat (Abb. 3d). Die zentrale Hüllenkomponente kann innerhalb eines Rings in derselben Schicht nicht miteinander interagieren, und alle Wechselwirkungen zwischen Ringen sind auf die Grate beschränkt (Abb. 3a, d). Die atomaren Strukturen zeigen, dass die Mantelverlängerungen ein „Netz“ bilden können (Abb. 3d).

Die Röhre anderer kontraktiler Injektionssysteme, wie z. B. Phagen T430, Pyocine vom R-Typ31, Serratia entomophila antifeeding prophage (afp)32 und das bakterielle Sekretionssystem vom Typ VI (T6SS)33,34, zeigen die Fähigkeit, verschiedene Substrate zu translozieren Die Art des Substrats bestimmt die Eigenschaften des Kanals der Röhre30. Die Röhre des Phagen ϕKp24 zeigt eine ähnliche Funktion.

Die Struktur des Röhrenproteins (gp119, Zugangsnummer QQV92088.1, Abb. 4a) wurde mit AlphaFold2 vorhergesagt und flexibel in die ϕKp24-Schwanz-EM-Karte eingepasst. Wir haben gp119 verwendet, um ein Modell der Röhre des Phagen ϕKp24 zu erstellen. Eine ringförmige Struktur bestehend aus sechs Röhrenproteinen stellt eine Baueinheit der inneren Röhre des Phagen ϕKp24 dar (Abb. 4b, c). Es gibt zwei hervorstechende Merkmale von gp119: (1) die lange C-terminale Verlängerung kann ein anderes gp119 erreichen, das sich in der Schicht direkt darüber (in Richtung des Kapsids) befindet; (2) Die N-terminale Domäne kann sich bis zu einem benachbarten gp119 in derselben Scheibe erstrecken (Abb. 4b). Im Vergleich zum Röhrenproteinmonomer gp19 (PDB: 5W5F) des Phagen T4 zeigt gp119 keine Sequenzähnlichkeit, aber eine ähnliche Faltung im Kern (gp19 hat eine kürzere C-terminale Verlängerung und eine kleinere N-terminale Domäne) (Ergänzende Abbildung 21a). . Sowohl gp119 als auch gp19 haben zwei Schichten von β-Faltblättern gemeinsam. Darüber hinaus können sich zwei lange Anti-β-Faltblätter bis zum benachbarten Röhrenprotein in derselben Scheibe erstrecken. (Ergänzende Abbildung 21). Die Innenfläche des Röhrchens weist eine ausgeprägte negative Ladung auf (Abb. 4d), die verhindert, dass die negativ geladene Phagen-DNA an der Oberfläche haftet.

ein Banddiagramm des vorhergesagten AlphaFold2-Modells des Röhrenproteinmonomers gp119 von ϕKp24, regenbogenfarben in ChimeraX. b Banddiagramm von zwei Scheiben (Hexameren) im Röhrchen des Phagen ϕKp24, ein typisches gp119 wurde in Regenbogenfarbe dargestellt. c Schnittansicht als Banddiagramm der Rohrstruktur (drei Scheiben). d Elektrostatische Diagramme, die die Innenfläche der Rohrstruktur in c zeigen. Ladungsverteilung: rot = negativ; blau = positiv; weiß = neutral. Das elektrostatische Potenzial wurde in ChimeraX eingefärbt. e Seitenansichten der Schnittstelle zwischen einem Teil des Hüllenproteins (C-terminale Domäne der zentralen Hülle) und vier Röhrenprotein-Untereinheiten. Der Rest R623 von gp118 kann mithilfe einer Salzbrücke mit dem Rest D268 von gp119 interagieren (der vergrößerte rechteckige Kasten oben links). f Die geladene Oberfläche von e. g Eine offene Buchansicht von f. Die komplementären Bereiche wechselwirkender Ladungen sowohl auf der Hülle als auch auf der Röhre sind durch Ovale markiert.

Wechselwirkungen zwischen Mantel und Rohr können durch elektrostatische und nichtkovalente Kräfte sowie durch die Viskosität im nanoskaligen Spalt (interstitielles Wasser) zwischen dem Endrohr und der umgebenden Hülle entstehen35. Die elektrostatischen Kräfte wirken weitgehend senkrecht zur Endrohrachse und tragen so zur Verbindung zwischen Mantel und Endrohr bei. Beim Phagen ϕKp24 interagiert die Hülle über Wasserstoffbrückenbindungen mit der inneren Röhre: Der Rest R623 des Hüllenproteins gp118 kann über eine Salzbrücke mit dem Rest D268 des Röhrenproteins gp119 interagieren (Abb. 4e). Darüber hinaus verbindet sich das Hüllprotein gp118 über elektrostatische Wechselwirkung mit Untereinheiten der inneren Röhre (Abb. 4g). Die Außenfläche der Röhrenuntereinheiten weist einen positiv geladenen Fleck auf (Abb. 4g, rechtes Feld). Die C-terminale Domäne des Hüllproteins bindet über einen komplementär negativ geladenen Fleck auf einer seiner beiden α-Helices an den Patch der Röhre.

Es ist bekannt, dass das Schwanzrohr eine entscheidende Rolle beim Aufbau der Hülle im ausgestreckten Zustand der Phagenschwänze spielt36. Ähnlich wie bei anderen Phagenschwanzsystemen schlagen wir vor, dass der Aufbau der ϕKp24-Hülle an der Grundplatte beginnt, wie dies beim Phagen T437 der Fall ist. Das Rohr und die Grundplatte können eine „Plattform“ bilden, an die sich die erste Scheibe der Untereinheiten der Hülle bindet. Anschließend dienen das Rohr und die Scheibe der erweiterten Hüllenuntereinheiten als Gerüst für den Zusammenbau der restlichen Hülle. Somit wird der Aufbau des kontrahierten Zustands durch die Schaffung einer Schablone vermieden, in der Hüllenuntereinheiten entlang des Kamms ohne seitliche Kontakte interagieren (Abb. 3d). Dieser templatgesteuerte Aufbau führt wahrscheinlich zu einer metastabilen oligomeren Struktur, die durch die Grundplatte zur Schwanzkontraktion bei Interaktion mit der Zielzelloberfläche freigegeben werden könnte.

Um die Strukturen und Konformationsänderungen der Schwanzfasern während der Zellanheftung und Genominjektion zu untersuchen, verwendeten wir Kryo-ET. Wir haben ϕKp24 zusammen mit seinem K. pneumoniae-Wirt abgebildet und intakte Phagen in vier verschiedenen Zuständen beobachtet: freie Partikel mit und ohne DNA und adsorbierte Partikel mit und ohne DNA. Diese vier Zustände entsprechen vier verschiedenen Zuständen während einer Phageninfektion: freie Phagen, am Wirt befestigte Phagen in der Frühphase der Infektion, noch an der Zelle befestigte (leere) Phagen nach der Infektion und freie (leere) Phagen nach der Infektion. Ein repräsentatives 2D-Kryo-ET-Bild (Abb. 5a) zeigt mehrere dieser Zustände. Um die Architektur ungeordneter Fasern zu verschiedenen Zeitpunkten des Infektionsprozesses zu finden, konzentrierten wir uns auf intaktes ϕKp24, das an eine K. pneumoniae-Zelle gebunden war. Wir haben intakte Phagen aus 89 entrauschten 3D-Rekonstruktionen in IMOD38 ausgewählt und extrahiert.

ein 2D-Kryo-ET-Bild, das verschiedene Zustände des Phagen ϕKp24 in seiner natürlichen Umgebung zeigt: freie Phagen (Phagen mit dunklen Kapsiden, blauer Pfeil), Phagen im Frühstadium der Infektion (Phagen mit dunklen Kapsiden und an der Wirtsmembran befestigt, schwarzer Pfeil), Mitte -Infektionsphagen (Phagen mit halbdunklen Kapsiden, die an der Wirtsmembran befestigt sind, grüner Pfeil) und Phagen nach der Infektion (leer), die noch an der Zelle haften (weißer Pfeil). b Beschnittene Tomogramme des Phagen ϕKp24 und manuelle Segmentierungen. Die erste Spalte zeigt sieben repräsentative Tomogramme von ϕKp24 in verschiedenen Zuständen während der Injektion. Von oben nach unten zeigt das erste Tomogramm einen freien Phagen (vollständiges Kapsid), das zweite bis vierte Tomogramm zeigt Phagen im Frühstadium der Infektion (vollständige Kapside), die an einer Zelle befestigt sind, und das fünfte bis siebte Tomogramm zeigt Phagen nach der Infektion (leer). Kapside), die an den Wirt gebunden sind. Die zweite Spalte zeigt sieben manuelle Segmentierungen der Schwanzfasern, die den links gezeigten Tomogrammen entsprechen. Die Hülle ist lila gefärbt, die Fasern sind cyanfarben und die Röhre ist gelb gefärbt. Die dritte Spalte zeigt die Seitenansicht jeder linken Segmentierung nach Drehung um 90°.

Aufgrund der hohen Komplexität und Heterogenität der Schwanzfasern haben wir uns entschieden, die Schwanzfasern manuell mithilfe der IMOD-Segmentierungsfunktion zu segmentieren38. Wir haben zunächst Teilvolumina einzelner Phagen aus den gesamten Tomogrammen extrahiert (Abb. 5b). Hier zielten wir darauf ab, Phagen auszuwählen, die sich in verschiedenen Stadien der Infektion befanden, vom Zustand vor der Infektion bis zum Zustand nach der Infektion. Anschließend segmentierten wir die Phagenschwänze dieser Phagen (Abb. 5b) und verglichen ihre Gesamtarchitektur. Wir fanden heraus, dass Fasern von Präinfektionsphagen in einer nahezu kugelförmigen Organisation um die Grundplatte herum angeordnet sind. Wenn sich Phagen dagegen an eine Wirtszelle anheften, interagieren die Fasern mit Bindungsstellen auf der Zellhülle und verändern so die Gesamtarchitektur. Die Schwanzfasern ordnen sich entlang der Zelloberfläche an und bilden eine flache „Schwanzplatte“. Darüber hinaus beobachten wir, dass der Schwanz der angehefteten Phagen nicht vertikal in Bezug auf die Zellhülle angeordnet ist. Stattdessen ist es geneigt. Dies könnte zwar ein Artefakt der Probenvorbereitung sein, es ist jedoch in manchen Fällen auch möglich, dass die Injektion des Genoms schräg erfolgt.

Aufgrund der zeitaufwändigen manuellen Segmentierung der Schwanzfasern haben wir ein neuronales Netzwerk39 aufgebaut, um die Schwanzfasern des Phagen ϕKp24 in rekonstruierten Tomogrammen automatisch zu erkennen. Wir haben das Netzwerk mithilfe der manuellen Segmentierung der Schwanzfasern trainiert und nach mehreren Optimierungsrunden das trainierte Netzwerk auf alle Tomogramme angewendet und 3D-Karten mit Schwanzfaserstrukturen erstellt. Wir definieren die Phagen vor der Infektion wie folgt: (1) das Kapsid ist voll, (2) der Schwanz ist verlängert, (3) der Phagen ist intakt und (4) der Phagen steht nicht in Kontakt mit einer Bakterienzelle. In ähnlicher Weise definieren wir die Phagen nach der Infektion wie folgt: (1) das Kapsid ist leer, (2) der Schwanz ist zusammengezogen und (3) es gibt einige Verbindungen zwischen den Faserspitzen und der Zellmembran. Nach der Extraktion und Formatumwandlung wurden 89 Schwanzfaserstrukturen von Phagen vor der Infektion und 338 Schwanzfaserstrukturen von Phagen nach der Infektion erzeugt. 40 repräsentative Schwanzfaserstrukturen vor der Infektion und Schwanzfaserstrukturen nach der Infektion werden durch visuelle Inspektion ausgewählt und in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 24, 25. Diese 3D-Strukturen zeigen deutlich, dass jede Schwanzfaserstruktur eine andere Konformation aufweist. In der Phagengruppe vor der Infektion (ergänzende Abbildung 24) sind die Schwanzfasern nahezu kugelförmig um die Grundplatte herum angeordnet. Der Größenbereich der Schwanzfaserstrukturen beträgt etwa 110–130 nm Höhe, 150–170 nm Länge und 90–130 nm Dicke. In der Phagengruppe nach der Injektion (ergänzende Abbildung 25) sind die meisten Schwanzfaserstrukturen in einer ovalen, scheibenartigen Konfiguration angeordnet. Der Größenbereich in 3D beträgt 120–150 nm Höhe, 160–190 nm Länge und 60–100 nm Dicke.

Um die Konformationsänderungen der Schwanzfasern in den Stadien vor und nach der Infektion weiter aufzudecken, wurden die Karten innerhalb jeder Gruppe aneinander angepasst und gemittelt, um „kanonische“ Faserformen zu erzeugen. Schließlich erhielten wir die überlagerten 3D-Strukturen der Schwanzfasern vor der Infektion (Abb. 6a) und nach der Infektion (Abb. 6b), die deutlich eine Konformationsänderung der Schwanzfasern von einer nahezu kugelförmigen Form zu einer flachen Scheibe zeigen. Zwischen diesen Konfigurationen ändert sich die Dicke um etwa 40 nm. Darüber hinaus steht der Schwanz der nach der Infektion überlagerten Struktur nicht senkrecht zur Faserscheibe, was darauf hindeutet, dass der Schwanz während der DNA-Injektion nicht senkrecht zur Wirtsoberfläche ausgerichtet ist. Dies zeigt sich auch an den individuellen Strukturen der Schwanzfasern und manuellen Segmentierungen. Wir haben eine Animation erstellt, die die Anheftung des Phagen ϕKp24, die Neuanordnung der Schwanzfasern und den DNA-Auswurf veranschaulicht (Zusatzfilm 2).

eine 3D-überlagerte Struktur von Schwanzfasern in Phagen vor der Infektion. 89 Schwanzfaserstrukturen von Phagen vor der Infektion wurden ausgerichtet und gemittelt. Das rechte Bild zeigt die Seitenansicht der Struktur nach einer Drehung um 90°. Sowohl das äußere Kästchen als auch die rote Linie sind Maßstabsbalken mit Pixeleinheiten. Die Größe des äußeren quadratischen Kastens beträgt 200 Pixel, die Pixelgröße beträgt 1,312 nm. Die Größe der Schwanzfaserstruktur beträgt ~137,8 nm Länge, 78,7 nm Höhe und 104,9 nm Dicke. b 3D-überlagerte Struktur der Schwanzfasern in Phagen nach der Infektion. 338 Schwanzfaserstrukturen von an den Wirt gebundenen Phagen nach der Infektion wurden ausgerichtet und gemittelt. Die Schwanzfaserstruktur ähnelt einer abgeflachten Scheibe. Die Größe beträgt 177,1 nm Länge, 118,1 nm Höhe und 65,6 nm Dicke. c Schematische Darstellung der Phagenhülle (lila), des Innenrohrs (gelb) und der Struktur der Schwanzfasern (cyan). Hier haben wir die Höhe, Länge und Dicke der Struktur definiert.

Zur Charakterisierung der Infektiosität von ϕKp24 wurde eine Sammlung von Stämmen mit 77 verschiedenen Kapselserotypen (K-Typ) verwendet. Diese Analyse ergab neun repräsentative Serotypenstämme (K2, K13, K19, K25, K35, K46, K61, K64 und K81), die für ϕKp24 anfällig sind, mit einer Plattierungseffizienz im Bereich von 1–0,001 im Vergleich zum ϕKp24-Wirtsstamm (ergänzende Abbildung). 26 und ergänzende Daten 1). Sequenzähnlichkeit40 und strukturbasierte Homologiemodellierung41 legen jedoch nahe, dass der Phagen vierzehn Schwanzfaserproteine ​​trägt (gp168, gp196, gp294, gp295, gp300, gp301, gp303, gp304, gp306, gp307, gp308, gp309, gp310 und gp313; Tabelle 1) anstelle der neun zuvor vorhergesagten11. Diese Proteine ​​besitzen mutmaßlich depolymerisierende Aktivität (Lyase oder Hydrolase) und eine β-helikale Faltung, was ein charakteristisches Merkmal für Klebsiella-Phagen-Depolymerasen ist. Für fünf von ihnen kann ein mutmaßlicher K-Serotyp basierend auf der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen mit experimentell bestätigten Depolymerasen vorhergesagt werden (Tabelle 1). Die Modellierung der vierzehn Proteine ​​mit RoseTTAFold42 ergab eine typische längliche hervorstehende Form, die aus parallelen β-Strängen orthogonal zur Längsachse besteht (Abb. 7, Zusatzdaten 2).

Eine schematische Darstellung der verschiedenen Module in 14 vorhergesagten Schwanzfasern ergibt vier Gruppen (G1, G2, G3 und G4) entsprechend der Länge ihrer Strukturmodule. Beachten Sie, dass die relativen Ausrichtungen der einzelnen Domänen in der vorhergesagten Struktur anders sein können als dargestellt. b Vierzehn vorhergesagte Schwanzfaserstrukturen. Schwanzfasern mit Depolymeraseaktivität bestehen typischerweise aus Strukturmodulen, die für die Schwanzbefestigung und -verzweigung verantwortlich sind (blau), einer trennenden α-Helix (grün) und einer β-Helix mit enzymatischer Aktivität (gelb). c Ein Hyperverzweigungsmodell der Schwanzfasern von ϕKp24.

Phagen der Menlow-Gruppe 8 (KpS110 und 0507-KN2-1) und der Phagen ΦK64-1 Gruppe 6 (ΦK64-1 und RaK2) sind die Klebsiella-Phagen mit dem kompliziertesten Schwanzfaserapparat, der bisher beschrieben wurde und zwischen fünf und elf Schwanzfasern umfasst . Der N-Terminus (Abb. 7, blaue Elemente) von Klebsiella-Phagenschwanzfasern spielt typischerweise eine strukturelle Rolle und ist entweder an der Bindung an die Phagenschwänze oder an eine andere Schwanzfaser oder an der Bereitstellung einer Andockstelle für andere Schwanzfasern beteiligt8. Der C-Terminus (Abb. 7, gelbe Elemente) enthält die enzymatische Depolymerasedomäne, die die Spezifität des Kapselserotyps definiert, und weist eine β-helikale Faltung auf. Der C-Terminus kann auch zusätzliche Chaperon- oder Kohlenhydrat-bindende Domänen umfassen43,44,45,46,47. Der N- und C-Terminus sind typischerweise durch eine α-Helix48 getrennt (Abb. 7, grüne Elemente). Die vierzehn mutmaßlichen Depolymerasen von ϕKp24 wurden basierend auf der Länge des N-terminalen Strukturteils in vier Gruppen (G1–G4) eingeteilt. Der längste N-terminale Teil von gp306 weist darauf hin, dass gp306 (G1) die primäre Schwanzfaser ist. In unserem Modell (Abb. 7c) befestigt seine große N-terminale Strukturdomäne das vollständige hyperverzweigte Schwanzfasersystem an der Grundplatte und dient über spezifische T4gp10-ähnliche Domänen als Andockstelle für sekundäre Schwanzfasern (Verzweigungssystem). Diese Domänen wurden zuvor experimentell in den verzweigten Schwanzfasersystemen der Phagen G7C49 und CBA12050 bestätigt. Sekundäre Schwanzfasern können zusätzliche Andockstellen für tertiäre Schwanzfasern umfassen, wie für Phagen beschrieben, die zur Phagengruppe der Menlow-Gruppe gehören8. Daher entsprechen die vier verschiedenen Gruppen eher peripheren Positionen in der Schwanzfaseranordnung. Die HHPred51-Analyse (Supplementary Data 2) ergab in gp306 (G1) und gp301 (G2) das Vorhandensein einer langen T4gp10-ähnlichen Falte, die Andockstellen für mehr als eine Schwanzfaser umfasst. Gruppe 3 (G3) enthält neun Proteine ​​(gp168, gp196, gp300, gp303, gp304, gp307, gp308, gp309 und gp310) mit kürzerer N-terminaler Struktur, aber ausreichend, um eine Domäne zu beherbergen, die für die Bindung an eine Andockstelle verantwortlich ist. Nur eine Schwanzfaser mit vorhergesagter Depolymeraseaktivität besitzt ein kurzes N-terminales Peptid (51 aa), das der trennenden α-Helix vorausgeht, nämlich gp313 (G4). Dieses Peptid könnte die Bindung an eine andere Schwanzfaser vermitteln. Insgesamt scheint die Schwanzfaserarchitektur von ϕKp24 in hyperverzweigten peripheren Schichten organisiert zu sein, wobei gp306 als primäre Schwanzfaser fungiert

Das zunehmende Problem der Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Krankheitserregern führte zu einem erneuten Interesse an der Verwendung von Phagen zur Behandlung antibiotikaresistenter bakterieller Infektionen. Für den optimalen Einsatz von Phagen in therapeutischen Anwendungen müssen wir unser Verständnis ihrer Struktur und Funktion verbessern. Der kürzlich beschriebene Klebsiella-Phage ϕKp24 ist ein vielversprechender Phagenkandidat mit einem erweiterten Wirtsspektrum, der mindestens neun verschiedene Kapseltypen infiziert und wahrscheinlich sogar noch mehr, basierend auf den vierzehn vorhergesagten Schwanzfasern mit Depolymeraseaktivität.

Die Aufklärung der einzigartigen Morphologie stellt eine Herausforderung für detaillierte Strukturstudien dar. Insbesondere die Größe des Kapsids und die heterogene Beschaffenheit der Schwanzfasern stellen eine Herausforderung für die Datenerfassung und -analyse dar. Sie erfordern die Kombination verschiedener Strukturmethoden zur Lösung der Gesamtstruktur. Algorithmen zur Vorhersage der Proteinstruktur wie AlphaFold2 und RoseTTAFold sind zu unschätzbaren Werkzeugen für die kryo-EM-basierte Aufklärung der makromolekularen Struktur geworden. Darüber hinaus bietet maschinelles Lernen eine neue Möglichkeit, komplexe Bilddaten der Kryo-ET zu analysieren. In dieser Studie haben wir Einzelpartikelanalyse und Kryo-Elektronentomographie mit Proteinstrukturvorhersage, molekularen Simulationen und maschinellem Lernen kombiniert. Dies ermöglichte es uns, die Struktur des ϕKp24-Partikels sowie charakteristische morphologische Veränderungen aufzudecken, die der Phagen während der Wirtsinfektion erfährt.

Die große Größe insbesondere des Kapsids stellt zusammen mit einer großen Datenmenge auch rechnerische Herausforderungen bei der Datenverarbeitung dar. Genauer gesagt beträgt der Durchmesser des Kapsids von ϕKp24 etwa 1450 Å. Entsprechend dem fallenden Gradienten der FSC-Kurve in Relion musste der für die endgültige 3D-Verfeinerung verwendete Datensatz um das 1,5-fache gruppiert werden, um die endgültige Auflösung mit den verfügbaren Rechenressourcen in Einklang zu bringen. Das leere Kapsid wurde mit einer Auflösung von 4,1 Å rekonstruiert, was aufgrund der Pixelgröße (2,055 Å) die höchste Auflösung ist, die wir von den Partikeln erwarten können. Das leere Kapsid von ϕKp24 ist derzeit das Kapsid mit der höchsten Auflösung aller in der EMDB (der Electron Microscopy Data Bank) hinterlegten Jumbo-Phagen.

Der Hauptstrukturbestandteil des Kapsids ist das MCP gp372. Dieses ungewöhnlich große Protein ist die Basis für die Hexamere und Pentamere, die das Kapsid bilden. Typischerweise bestehen Phagenkapside aus einem (oder zwei) MCPs und Dekorationsproteinen (zusätzlichen externen Proteinen, die die MCPs miteinander verbinden). Unsere Rekonstruktion des Kapsids von ϕKp24 hat gezeigt, dass das gesamte Kapsid von ϕKp24 durch ein einziges MCP allein zusammengesetzt werden kann.

Bei den Hexameren bilden die sechs langen C-terminalen Schleifen eine Pore im Zentrum eines Hexamers. Eine ähnliche Pore wurde unseres Wissens bisher noch nicht in anderen Phagenkapsiden beschrieben. Die genaue Funktion dieser Pore ist derzeit unklar. Es wurde jedoch über Poren bei Viren berichtet, beispielsweise bei HIV-1. Dieses Virion nutzt dynamische Kapsidporen, um Nukleotide zu importieren und die eingekapselte DNA-Synthese anzutreiben52. Wir spekulieren, dass die Pore von ϕKp24 am Ausgleich von Druckunterschieden während des Ladens der DNA in das Kapsid oder während des DNA-Ausstoßes, wenn die Kapsidgröße zunimmt, beteiligt sein könnte.

Es besteht eine evolutionäre Verbindung zwischen einigen Phagenschwanzproteinen und dem Sekretionssystem (T6SS) des gramnegativen Bakteriums Typ VI, das an verschiedenen virulenzbezogenen Prozessen beteiligt ist53,54,55. Die hier beschriebene Struktur der kontraktilen Hülle weist starke Ähnlichkeiten zu anderen kontraktilen Systemen auf, wie zum Beispiel Pyocin31 und T430 vom R-Typ. Dies legt nahe, dass der helikale Schwanz des Phagen ϕKp24 auf ähnliche Weise funktioniert. Darüber hinaus legt die hier gelöste Struktur nahe, dass die die Untereinheiten verbindenden Verlängerungen (C-terminale Verlängerung) des Hüllenproteins gp118 während der Kontraktion als Scharniere fungieren, wobei die zentrale Hülle von gp118 wahrscheinlich ihre Struktur beibehält. Die Neuordnung der Untereinheiten der Hülle bei der Kontraktion führt zu einer viel dichter gepackten Struktur. Hier werden die Grate näher zusammengebracht, um teilweise ineinandergreifend zu sein. Im kontrahierten Schwanz gehen die Verbindungen zum Innenschlauch verloren, sodass der Schlauch während der Infektion in die Zielzellmembran eindringen kann31.

Die Tomogramme zeigen, dass die Schwänze der anhaftenden Phagen im Verhältnis zur Zellhülle nicht vertikal erscheinen. Stattdessen sind die Schwänze von Phagen mit vollen oder leeren Kapsiden geneigt. Obwohl wir nicht ausschließen können, dass es sich bei dieser Beobachtung um ein Artefakt aus der Probenvorbereitung handelt, kann dieser Zusammenhang physiologisch relevant sein. Ein geneigter Schwanz kann die erforderliche Energie für die Kontraktion und den DNA-Auswurf sowie die Beschädigung der Zellhülle verringern, um eine vorzeitige Lyse des Wirts zu verhindern.

Im Gegensatz zum Kapsid und zum Schwanz sind die Schwanzfasern strukturell sehr heterogen und für die Einzelpartikelanalyse nicht geeignet. Durch die Verwendung eines neuronalen Netzwerks, das speziell für genaues Training mit einer begrenzten Anzahl von Beispielen entwickelt wurde56, konnten wir ein Netzwerk mithilfe der Segmentierung der Schwanzfasern von nur sieben Phagenpartikeln trainieren und so die arbeitsintensive manuelle Segmentierung begrenzen. Nach dem Training erfolgte die netzwerkgestützte automatische Analyse der Schwanzfasern von mehr als 600 Phagen und demonstrierte die Möglichkeiten des maschinellen Lernens zur Unterstützung der Analyse komplexer Strukturen.

Die Schwanzfaserdaten zeigten die außerordentliche Komplexität dieser Schwanzfasern und eine signifikante Veränderung in ihrer Anordnung zwischen freien Phagen und denen, die an eine Wirtszelle gebunden sind. Während sich die Fasern kugelförmig um die Schwanzspitze eines freien Phagen anordnen, passen sich die Schwanzfasern bei wirtsgebundenen Phagen der Wirtshülle an und bilden eine Platte. Bemerkenswert ist, dass die Konformationsänderung der Schwanzfasern der DNA-Freisetzung vorausgeht. Daher kann es Teil des Auslösemechanismus selbst sein.

Die Analyse des Wirtsbereichs von ϕKp24 ergab eine beispiellose Anzahl von Kapselserotypen, auf die dieser Phagen abzielt. Diese Beobachtung entspricht den mehreren Schwanzfasern mit spezifischer Depolymeraseaktivität, die im großen Phagengenom vorhergesagt wurden, und dem stark verzweigten Schwanzfasersystem, das sichtbar gemacht werden konnte. Die Strukturanalyse der Schwanzfasern weist auf eine umfangreiche Strukturarchitektur zur Integration aller Schwanzfasern im Phagenpartikel hin, wobei gp306 als primärer Schwanzfaserkandidat auftaucht und direkten Kontakt mit dem Phagenschwanz herstellt, während nachfolgende Gruppen von Schwanzfasern eine zunehmend verkürzte Strukturdomäne aufweisen , was auf einen eher peripheren Standort hindeutet.

Zusammenfassend stellen die Erkenntnisse aus dieser neuartigen Kombination verschiedener Methoden eine wesentliche Grundlage für die Entwicklung potenzieller klinischer Anwendungen dar. Kürzlich wurde die Phagentherapie erfolgreich zur Behandlung einer Infektion eingesetzt, die durch einen panresistenten K. pneumoniae-Stamm verursacht wurde13. Der hier ermittelte erweiterte Wirtsbereich von ϕKp24 könnte es zu einem attraktiven Kandidaten für die Entwicklung einer Phagentherapie machen.

Die in dieser Studie verwendeten K. pneumoniae-Referenzstämme (Supplementary Data 1) wurden von der Collection de l'Institut Pasteur (CIP, Paris, Frankreich, CIP-gekennzeichnete Stämme) bezogen oder von der National Collection of Type Cultures (NCTC-gekennzeichnete Stämme) erworben. . Die Bakterien wurden bei –70 ° C in Trypticase-Sojabrühe (TSB, Becton Dickinson and Company, Cockeysville, MD, USA), ergänzt mit 20 % Glycerin, gelagert.

Der Phagen ϕKp24 (Genbank-Zugangsnummer MW394391) wurde zuvor aus Abwasser isoliert11. ϕKp24 wurde in 2 l Lysogeny Broth (LB) unter Verwendung des K. pneumoniae-Stamms K5962 als Wirt (Genbank Bioproject-Zugangsnummer PRJNA745534) kultiviert. Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert (9000 × g, 15 Min.) und der phagenhaltige Überstand wurde filtersterilisiert. Das Phagenlysat wurde dann mit SM-Puffer (100 mM NaCl, 8 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl pH 7,5) gewaschen und 10x unter Verwendung einer Tangentialflusskassette (100 kDa PES Vivaflow 200, Sartorius, Deutschland) konzentriert. Der Phagentiter wurde zum Nachweis von Phagen bestimmt, indem serielle Verdünnungen der Phagenlösung auf Doppelschicht-Agarplatten des Stammes K5962 aufgetragen wurden.

Die Spot-Methode wurde verwendet, um die Serotypspezifität und die potenzielle Produktion von Kapsel-Targeting-Depolymerasen durch den Phagen ϕKp24 zu bestimmen. Die Analysen wurden an der Sammlung des K. pneumoniae-Serotyps durchgeführt (Ergänzungsdaten 1, 2). Die Bakterienkulturen über Nacht wurden in frischem TSB suspendiert, 2 Stunden lang bei 37 °C unter Rühren (140 U/min) inkubiert und auf Trypticase-Soja-Agar-Platten (TSA, Becton Dickinson and Company, Cockeysville, MD, USA) gegossen. Nach dem Trocknen wurden 10 µL zehnfacher Reihenverdünnungen des Phagen ϕKp24 (109 PFU/ml als Ausgangskonzentration) auf Bakterienrasen getupft. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden die Rasenflächen auf Plaque- und Halo-Zonen untersucht. Die Effizienz der Ausplattierung wurde berechnet, indem der Titer des Phagen bei der Endverdünnung auf dem Teststamm durch den Titer desselben Phagen auf seinem Wirtsstamm dividiert wurde.

Die Genomsequenz des Phagen ϕKp24 wurde aus der GenBank-Datenbank (NCBI-Zugangsnummer MW394391) erhalten. Alle Proteine ​​des Phagen ϕKp24 wurden mit Phyre241 auf der Suche nach mutmaßlichen Schwanzfasern mit Depolymeraseaktivität analysiert. Kriterien für die Vorhersage der mutmaßlichen Depolymeraseaktivität waren wie in8 mit einigen Modifikationen: (1) das Protein ist länger als 200 Reste; (2) das Protein ist in der NCBI-Datenbank als Schwanz/Schwanzfaser/Schwanzspike/hypothetisches Protein gekennzeichnet; (3) das Protein zeigt Homologie zu Domänen, die als Lyase [Hyaluronat-Lyasen (Hyaluronidasen), Pektin/Pektat-Lyasen, Alginat-Lyasen, K5-Lyasen] oder Hydrolase (Sialidasen, Rhamnosidasen, Levanasen, Dextranasen, Xylanasen, Glucosidase, Galacturonase, Galacturonosidase) bezeichnet sind. Glucanase ) mit einer Konfidenz von mindestens 40 % in Phyre2; (4) die Länge der Homologie mit einer dieser Enzymdomänen sollte mindestens 100 Reste umfassen; (5) Eine typische β-helikale Struktur sollte von Phyre2 vorhergesagt werden. Die vorhergesagten Proteine ​​wurden mit RoseTTAFold42 modelliert. Die vorhergesagten Modelle wurden weiter analysiert und die letzte α-Helix vor der β-helikalen Struktur als Endpunkt für den N-terminalen Strukturteil gewählt. Die Proteine ​​wurden nach der Länge des N-terminalen Strukturteils geordnet, beginnend mit dem längsten. Die Proteine ​​wurden mit BlastP40 und HMMER57 weiter analysiert. BlastP wurde verwendet, um die Serotypspezifität basierend auf den Aminosäuresequenzähnlichkeiten der in der Datenbank gefundenen Depolymerasen zu bestimmen. Für die Analyse wurden folgende Kriterien festgelegt: (i) das homologe Protein sollte eine bestätigte Depolymeraseaktivität und Spezifität für den jeweiligen K. pneumoniae-Serotyp aufweisen, (ii) die Aminosäuresequenzidentität sollte 30 % überschreiten und (iii) die Länge Die Homologie sollte mehr als 100 Aminosäuren umfassen. Der N-Terminus jedes ausgewählten Proteins wurde mit HHPred51,58 mittels paarweiser Ausrichtung auf der Suche nach T4gp10-ähnlichen Domänen analysiert. Es wurden Standardparameter verwendet: MSA-Generierungsmethode: HHblits = >UniRef30; Iterationen der MSA-Generierung: 3; E-Wert-Grenzwert für die MSA-Erzeugung: 1e-3; Min. seq. Identität der MSA-Treffer mit Abfrage (%): 0; Min. Abdeckung von MSA-Treffern (%): 20; Bewertung der Sekundärstruktur: while_alignment; Ausrichtungsmodus: Neu ausrichten mit MAC: local:norealign; MAC-Neuausrichtungsschwelle: 0,3; Maximale Zieltreffer: 250; Mindestwahrscheinlichkeit in der Trefferliste (%): 20. Das Alignment wurde gegen T4gp10 (NP_049768.1), den N-Terminus von CBA120gp163 (orf 211, YP_004957865.1), CBA120gp165 (orf 213, YP_004957867.1) und G7Cgp66 (YP_0047) durchgeführt 82196 .1).

K. pneumoniae K5962 wurde über Nacht bei 30 °C unter Schütteln bei 180 U/min gezüchtet. Die Übernachtkultur wurde zum Animpfen von 10 ml frischem LB-Medium verwendet und 2 Stunden lang bei 30 °C und 180 U/min gezüchtet. Anschließend wurden 1,6 ml des Phagen ϕKp24 (9 × 1012 PFU/ml) zur Kultur gegeben und weitere 80 Minuten inkubiert. Die Kultur wurde visuell überprüft, um die Zelllyse zu bestätigen, und 200 µl wurden zentrifugiert (5000 × g, 5 Min.) und das Pellet wurde im gleichen Volumen an frischem Medium resuspendiert. Schließlich wurden 5 µl 10 nm große Goldkügelchen (Cell Microscopy Core, Universität Utrecht, Utrecht, Niederlande) zu 50 µl der vorbereiteten Bakterien-Phagen-Mischung gegeben. Unter Verwendung des Leica EM GP (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) wurden 3,8 µl der Mischung auf ein glimmentladenes Quantifoil R2/2, 200 Mesh Cu-Gitter (Quantifoil Micro Tools GmbH, Jena, Deutschland) aufgetragen und vor dem Blotting 30 s lang inkubiert bei 20 °C und ~95 % relativer Luftfeuchtigkeit. Die Bakterien-Phagen-Gitter wurden 1 s lang geblottet und automatisch in flüssiges Ethan getaucht. Verglaste Proben wurden in Aufbewahrungsboxen überführt und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.

ϕKp24 wurde wie folgt konzentriert: 1000 µl Phagen-ϕKp24-Flüssigkeit (9 × 1012 PFU/ml) wurden bei einer niedrigeren Geschwindigkeit (5 k) 2–3 Mal (15 min/pro Drehung) herunterzentrifugiert, bis der Puffer nicht mehr aus einem Proteinkonzentrator eluierte (10 kDa Zellulosefilter). Anschließend wurde die Probe sofort zum Tauchgefrieren verwendet. Unter Verwendung des Leica EM GP wurden 3,5 µl des konzentrierten Phagen zu einem glühentladenen Quantifoil R2/2, 200 Mesh Cu-Gitter gegeben und 10 s bei 18 °C und ~95 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Phagengitter wurden 0,7 s lang geblottet und automatisch in flüssiges Ethan getaucht. Verglaste Proben wurden bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Die Gitter mit K. pneumoniae K5962 und ϕKp24 wurden abgeschnitten und in einen Titan Krios (Thermo Fisher Scientific (TFS)) geladen, der mit einem K3 BioQuantum-Direktelektronendetektor und einem Energiefilter (Gatan, Inc) ausgestattet war und auf verlustfreie Bildgebung eingestellt war mit einer Spaltbreite von 20 eV. Bildgebungsziele wurden durch Auswahl von Bakterienzellen ausgewählt, die sich in einem Loch des Kohlenstofffilms des EM-Gitters befanden. Bakterien, die bei geringer Vergrößerung weniger dicht erschienen, deuteten auf eine fortgeschrittene Phageninfektion hin. Die Daten wurden als Filmbildstapel mit SerialEM gesammelt, das auf ein dosissymmetrisches Neigungsschema zwischen –54° und 54° mit Neigungsschritten von 2° eingestellt war59,60. Die gewählte Nennvergrößerung betrug 26.000, was einer Pixelgröße von 3,28 Å in den gesammelten Bildern entspricht. Die Defokussierung der gesammelten Daten lag im Bereich von –4 bis –6 µm. Die geschätzte Gesamtdosis pro Neigungsserie betrug 100 e/Å2.

ϕKp24-haltige Gitter wurden abgeschnitten und in ein Titan-Krios-Elektronenmikroskop (Thermo Fisher Scientific, TFS) geladen, das bei 300 kV betrieben wurde und mit einem Gatan K3 BioQuantum-Direktelektronendetektor (Gatan) ausgestattet war. Filme wurden mit EPU (Thermo Fisher Scientific, TFS) und AFIS (aberrationsfreie Bildverschiebung) im Superauflösungsmodus bei 64.000-facher Nennvergrößerung aufgenommen, was einer kalibrierten Pixelgröße von 0,685 Å mit einem Defokusbereich von –1 bis –5 entspricht µm und eine Gesamtdosis von 30 e/Å2 (siehe Datenerfassungsparameter in der Ergänzungstabelle. 1).

Bewegungskorrektur, Rahmenausrichtung, Neigungsreihenausrichtung mithilfe von Goldmarken und Tomogrammrekonstruktion wurden mit IMOD38 durchgeführt. Die Datensätze wurden um den Faktor 2 gruppiert. Aus den rekonstruierten Tomogrammen wurden ϕKp24-Phagen mit deutlich sichtbaren Grundplatten und Schwanzfasern zur Segmentierung mithilfe von IMOD ausgewählt. Die Visualisierung der Daten wurde von IMOD und Fiji61 durchgeführt.

Das Kapsid des Phagen ϕKp24 wurde mit Relion 3.1.213 rekonstruiert. MotionCorr62 wurde verwendet, um die strahlinduzierte Partikelbewegung zu korrigieren. Die Kontrastübertragungsfunktion wurde von CTFFIND 4.1.1863 geschätzt. Zunächst wurden 61 Kapsidpartikel manuell für die 2D-Klassifizierung ausgewählt, um Referenzvorlagen für die automatische Auswahl zu erstellen. Anschließend wurde die automatische Kommissionierung von Relion verwendet, um automatisch 290.280 Partikel auszuwählen, die zur 2D-Klassifizierung während der Extraktion in 4er-Gruppen eingeteilt wurden. Nach mehreren Runden der 2D-Klassifizierung wurden Partikel mit falsch positiven und kontaminierenden Merkmalen verworfen, was zu einem Datensatz mit 28.090 Partikeln führte, der dann in zwei Klassen eingeteilt wurde: leere Kapside und volle Kapside. Um die endgültige Auflösung und die Berechnungsgeschwindigkeit in Einklang zu bringen, wurde der Datensatz um das 1,5-fache mit einer endgültigen Pixelgröße von 2,055 Å, einer Partikelbox von 800 Pixeln und einem kreisförmigen Maskendurchmesser von 1600 Å heruntergesampelt. Anschließend wurden die extrahierten Partikel einer 3D-Vormodellierung und -klassifizierung unterzogen. Die Klasse mit der größten Partikelanzahl wurde für die abschließende 3D-Verfeinerung verwendet (dadurch werden teilweise DNA-gefüllte Kapside abgetrennt und entfernt). Schließlich wählten wir sowohl die leere Kapsidklasse als auch die Klasse des vollständigen Kapsids für die 3D-Verfeinerung getrennt unter Verwendung der ikosaedrischen I1-Symmetrie aus, und die Ewald-Kugelkorrektur unter Verwendung eines Einzelseitenband-Bildverarbeitungsalgorithmus64 wurde nach der 3D-Verfeinerung angewendet. Die endgültigen Rekonstruktionen wurden durch Relion-Nachbearbeitung geschärft und lokal gefiltert (Arbeitsablauf der 3D-Rekonstruktion, ergänzende Abbildung 2a). Die Kartenauflösung wurde anhand des 0,143-Kriteriums der phasenrandomisierungskorrigierten FSC-Kurve geschätzt, die zwischen zwei unabhängig verfeinerten Halbkarten multipliziert mit einer Lösungsmittelmaske mit weichen Kanten berechnet wurde. Die Karten wurden mit UCSF ChimeraX27 angezeigt.

Die spiralförmige Rekonstruktion wurde mit RELION 3.1.213 durchgeführt. Der mit einem Vollkapsid verbundene ϕKp24-Schwanz wurde manuell ausgewählt. Insgesamt 4707 manuell ausgewählte Segmente wurden mit einer 450-Pixel-Box extrahiert und anschließend zweidimensional klassifiziert. Der anfängliche Verdrehungswert wurde aus der beobachteten Kreuzungsentfernung in rohen Mikroaufnahmen und 2D-Klassendurchschnitten angenähert. Der höchste Anteil der Klassen mit klaren Grenzen wurde als Vorlage für die endgültige automatische Auswahl verwendet. Die Parameter für die helikale automatische Aufnahme wurden anhand einer Teilmenge von 741 Mikroaufnahmen optimiert. Nach der automatischen Auswahl aus dem gesamten Datensatz wurden 114.132 Partikel extrahiert und um 2 gruppiert. Es wurden mehrere Runden der 2D-Klassifizierung durchgeführt, um falsch positive Partikel und kontaminierende Merkmale zu entfernen. Die verbleibenden Partikel wurden mehreren Runden der 3D-Klassifizierung unterzogen, wobei ein konturloser Zylinder als anfängliches 3D-Modell verwendet wurde. Es wurde eine dreidimensionale Verfeinerung durchgeführt, gefolgt von einer 3D-Klassifizierung, bei der die Partikel in vier Klassen eingeteilt wurden. Partikel in der Klasse mit der größten Anzahl wurden ausgewählt, unter Verwendung nicht klassifizierter Daten erneut extrahiert und mit C6-Symmetrie dreidimensional verfeinert. Die Helixanstiegs- und -drehungsparameter für die endgültige 3D-Verfeinerung wurden mit HI3D25 aus dem Jiang-Labor analysiert (Ergänzungstabelle. 1). Der Helixanstieg und die Helixdrehung werden bei 39,03 Å bzw. 20,89 ° bestimmt. Die endgültigen Rekonstruktionen wurden mithilfe der Relion-Nachbearbeitung geschärft und lokal gefiltert (Arbeitsablauf für Helical-Rekonstruktion, ergänzende Abbildung 11). Die lokale Auflösung wurde in ResMap65 generiert (ergänzende Abbildung 12).

Die 3D-Strukturen von ϕKp24-Proteinen wurden mit Alphafold v2.0 über das ColabFold66-Notebook unter https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb abgeleitet. Erste Modelle der Kapsid-Hexamer- und Pentamer-Anordnungen wurden durch starres Andocken des von AlphaFold2 vorhergesagten gp372-Modells an entsprechende Regionen der Kapsid-Kryo-EM-Karte mithilfe von ChimeraX erstellt. Die zusammengestellten Modelle wurden dann separat unter Verwendung des Kaskaden-MDFF-Protokolls67 verfeinert, das sequentielle MDFF-Simulationen zu einer Reihe von Gauß-geglätteten Karten mit zunehmender Auflösung durchführt und mit der experimentellen Karte endet. Für jede Anordnung wurden insgesamt 5 × 1 ns MDFF-Simulationen durchgeführt, wobei Symmetriebeschränkungen auf die Grundgerüstatome jedes Monomers angewendet wurden. Das resultierende Hexamer-Modell wurde dann an die Dichten rund um die Hexamer- und Pentamer-Anordnungen angedockt, um erweiterte Kapsidmodelle zu erzeugen, die dann jeweils einer zusätzlichen 5-ns-MDF-Simulation unterzogen wurden. Alle Simulationen wurden mit NAMD v2.1468 und dem Kraftfeld CHARMM3669 durchgeführt. MDFF-Simulationen wurden im NVT-Ensemble bei 300 K und unter Verwendung eines verallgemeinerten impliziten Born-Lösungsmittels durchgeführt. Alle Rückgratatome wurden mit einer Kopplungskonstante von 0,3 an die Dichtekarte angepasst, wobei zusätzliche harmonische Beschränkungen angewendet wurden, um den Verlust der Sekundärstruktur, Chiralitätsfehler und die Bildung von cis-Peptidbindungen zu verhindern. Zusätzliche Parameter wurden als Standardwerte übernommen, die vom MDFF-Plugin in VMD70 bereitgestellt werden.

Die von AlphaFold2 vorhergesagte gp118-Struktur wurde mit ChimeraX starr in die Schwanzdichtekarte eingepasst, und die Hüllenregion wurde dann durch interaktive Molekulardynamiksimulation in ISOLDE26 flexibel eingepasst. Für die Realraumverfeinerung wurde das Softwarepaket PHENIX71 verwendet. Die Validierung einschließlich CC und RMSD anhand idealer Bindungslängen und -winkel wurde ebenfalls mit PHENIX analysiert (Ergänzungsabbildung 14 und Ergänzungstabelle 2). Um das Modell des Innenrohrs zu erstellen, analysierten wir zunächst alle Proteine ​​von ϕKp24 mit HMMER72, um das Endrohrprotein durch Homologiesuche zu identifizieren, da dieses in der Genbank-Datei nicht annotiert war. Als nächstes haben wir mithilfe von Alphafold2 die Struktur des Schwanzröhrenproteins gp119 vorhergesagt und diese als Vorlage für den Aufbau des Innenröhrenmodells verwendet. Das Modell wurde in ChimeraX starr in die entsprechenden Bereiche der Schwanzdichtekarte eingepasst, in ISOLDE optimiert und in der PHENIX-Anwendung unter Verwendung des starren Körpers und des realen Raums verfeinert. Die CC- und Verfeinerungsstatistiken, einschließlich RMSD aus idealen Bindungslängen und -winkeln, wurden von PHENIX analysiert (Ergänzungsabbildung 20 und Ergänzungstabelle 2).

Ein 100-schichtiges dichtes neuronales Netzwerk mit gemischter Skala39 wurde trainiert, um Phagen-ϕKp24-Schwanzfasern in rekonstruierten Tomogrammen zu erkennen. Hier haben wir einen ähnlichen Trainingsaufbau verwendet wie in anderen Studien, die dichte Netzwerke im gemischten Maßstab verwenden56,73,74. Für weitere Informationen zu diesem Trainingsaufbau verweisen wir auf diese früheren Studien. Für das Training wurden manuelle Segmentierungen der Schwanzfasern von sieben Phagen zusätzlich zu fünf manuell ausgewählten Regionen ohne vorhandene Fasern verwendet. Der ADAM-Algorithmus75 wurde verwendet, um den Kreuzentropieverlust zu minimieren, indem zufällige Rotationen und Flips zur Datenerweiterung verwendet wurden. Das Training wurde abgebrochen, nachdem keine signifikante Verbesserung des Verlustes zu beobachten war, was zu einer Trainingszeit von einigen Stunden führte. Anschließend wurde das trainierte Netzwerk auf alle Tomogramme angewendet, was zu 3D-Karten der Schwanzfaserstrukturen führte. Um diese Karten weiter zu analysieren, wurden die Tomogramme zusätzlich manuell mit Anmerkungen versehen, die für jeden Phagen Folgendes anzeigten: (1) die Mitte der Faserstruktur, (2) die Position des Kopfes und (3) ob der Kopf voll oder leer war , oder fehlt. Mithilfe dieser Informationen wurde aus den 3D-Faserkarten eine 3D-Karte der Faserstruktur jedes Phagen extrahiert, was zu individuellen Karten für 89 Phagen mit vollen Köpfen, 338 Phagen mit leeren Köpfen und 181 Phagen mit fehlenden Köpfen führte. Die Karten innerhalb jeder Gruppe wurden mithilfe der manuell kommentierten Positionsinformationen und der anschließenden automatischen Ausrichtung durch Maximierung der Kreuzkorrelation aneinander ausgerichtet. Die ausgerichteten Karten wurden dann gemittelt, um „kanonische“ Faserformen für jede Gruppe zu erzeugen. Die extrahierten Strukturen und gemittelten Strukturen wurden mit Paraview76 angezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie erstellten 3D-Kryo-EM-Karten wurden bei EMDB (der Electron Microscopy Data Bank, https://www.ebi.ac.uk/emdb/) mit dem Zugangscode EMD-13862 für leeres Kapsid des Klebsiella-Jumbo-Phagen hinterlegt ϕKp24, Code EMD-14356 für das vollständige Kapsid für den Klebsiella-Jumbo-Phagen ϕKp24 und Code EMD-14357 für eine Länge des verlängerten Schwanzes. Die in diesem Dokument gemeldeten Daten zur Proteinvorhersage werden auf Anfrage vom Hauptkontakt weitergegeben. Die in dieser Studie generierten Atomkoordinaten wurden bei wwPDB (Worldwide Protein Data Bank, http://www.wwpdb.org/) mit der Zugangs-PDB-ID: 8BFL für Hexamere des leeren Kapsids des Klebsiella-Jumbo-Phagen ϕKp24, PDB-ID: hinterlegt. 8BFP für Pentamer-Hexamere des leeren Kapsid-Klebsiella-Jumbo-Phagen ϕKp24, PDB-ID: 8AU1 für eine Länge der Außenhülle des verlängerten Schwanzes und PDB-ID: 8BFK für eine Länge der Innenröhre des verlängerten Schwanzes.

Der gesamte Originalcode wurde bei GitHub hinterlegt und ist öffentlich verfügbar unter https://github.com/dmpelt/jumbo-bacteriophage, https://doi.org/10.5281/zenodo.7277351. Alle zusätzlichen Informationen, die zur erneuten Analyse der in diesem Dokument gemeldeten Daten erforderlich sind, sind auf Anfrage beim Hauptkontakt erhältlich.

Murray, CJ et al. Globale Belastung durch bakterielle antimikrobielle Resistenzen im Jahr 2019: eine systematische Analyse. Lancet 399, 629–655 (2022).

Tacconelli, E. et al. Entdeckung, Forschung und Entwicklung neuer Antibiotika: die WHO-Prioritätenliste für antibiotikaresistente Bakterien und Tuberkulose. Lanzetteninfektion. Dis. 18, 318–327 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Ryan, KJ & Ray, CG Medizinische Mikrobiologie. McGraw Hill 4, 370 (2004).

Google Scholar

Ko, KS Der Beitrag von Kapselpolysaccharidgenen zur Virulenz von Klebsiella pneumoniae. Virulence 8, 485–486 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Follador, R. et al. Die Vielfalt der Oberflächenpolysaccharide von Klebsiella pneumoniae. Mikrob. Genomics 2, e000073 (2016).

Pan, Y.-J. et al. Der Klebsiella-Phage ΦK64-1 kodiert mehrere Depolymerasen für mehrere Wirtskapseltypen. J. Virol. 91, e02457–16 (2017).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Shimoliūnas, E. et al. Klebsiella-Phage vB_KleM-RaK2 – ein riesiges Singleton-Virus der Familie Myoviridae. PLoS One 8, e60717 (2013).

Artikel PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Latka, A., Leiman, PG, Drulis-Kawa, Z. & Briers, Y. Modellierung der Architektur von Depolymerase-haltigen Rezeptorbindungsproteinen in Klebsiella-Phagen. Vorderseite. Mikrobiol. 10, 2649 (2019).

Artikel PubMed Central PubMed Google Scholar

Hendrix, RW Jumbo-Bakteriophagen. in Lesser Known Large dsDNA Viruses 229–240 (Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg, 2009).

Yuan, Y. & Gao, M. Jumbo-Bakteriophagen: ein Überblick. Vorderseite. Mikrobiol. 8, 403 (2017).

Artikel PubMed Central PubMed Google Scholar

Bonilla, BE et al. Genomische Charakterisierung von vier neuartigen Bakteriophagen, die den klinischen Erreger Klebsiella pneumoniae infizieren. (Cold Spring Harbor Laboratory, 2021).

Cramer, P. AlphaFold2 und die Zukunft der Strukturbiologie. Nat. Struktur. Mol. Biol. 28, 704–705 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Scheres, SH RELION: Implementierung eines Bayes'schen Ansatzes zur Bestimmung der Kryo-EM-Struktur. J. Struktur. Biol. 180, 519–530 (2012).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Rosenthal, PB & Henderson, R. Optimale Bestimmung der Partikelorientierung, der absoluten Hand und des Kontrastverlusts in der Einzelpartikel-Elektronenkryomikroskopie. J. Mol. Biol. 333, 721–745 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Krylov, V., Dela Cruz, D., Hertveldt, K. & Ackermann, H.-W. „φKZ-ähnliche Viren“, eine vorgeschlagene neue Gattung von Myovirus-Bakteriophagen. Bogen. Virol. 152, 1955–1959 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Effantin, G. et al. Kryo-Elektronenmikroskopische dreidimensionale Struktur des Jumbo-Phagen ΦRSL1, der den Phytopathogen Ralstonia solanacearum infiziert. Struktur 21, 298–305 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Neumann, E. et al. 3D-Struktur von drei Jumbo-Phagenköpfen. J. General Virol. 101, 1219–1226 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Suhanovsky, MM & Teschke, CM Der Lieblingsbaustein der Natur: Entschlüsselung der Faltung und Kapsidassemblierung von Proteinen mit der HK97-Faltung. Virology 479, 487–497 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Duda, RL & Teschke, CM Die erstaunliche HK97-Faltung: vielseitige Ergebnisse bescheidener Unterschiede. Curr. Meinung. Virol. 36, 9–16 (2019).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Helgstrand, C. et al. Die verfeinerte Struktur eines Protein-Catenans: das Kapsid des Bakteriophagen HK97 mit einer Auflösung von 3,44 Å. J. Mol. Biol. 334, 885–899 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gan, L. et al. Kapsidkonformationsprobenahme bei der HK97-Reifung, sichtbar gemacht durch Röntgenkristallographie und Kryo-EM. Struktur 14, 1655–1665 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

McGreevy, R., Teo, I., Singharoy, A. & Schulten, K. Fortschritte in der flexiblen Anpassungsmethode der Molekulardynamik für die Kryo-EM-Modellierung. Methoden 100, 50–60 (2016).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Wikoff, WR et al. Topologisch verknüpfte Proteinringe im Kapsid des Bakteriophagen HK97. Science 289, 2129–2133 (2000).

Artikel CAS ADS PubMed Google Scholar

Kamiya, R. et al. Säurestabile Kapsidstruktur des Helicobacter pylori-Bakteriophagen KHP30 durch Einzelpartikel-Kryoelektronenmikroskopie. Struktur 30, 300–312.e3 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sun, C., Gonzalez, B. & Jiang, W. Spiralindizierung im realen Raum. Wissenschaft. Rep. 12, 8162 (2022).

Artikel CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Croll, TI ISOLDE: eine physikalisch realistische Umgebung für den Modellaufbau in niedrigaufgelösten Elektronendichtekarten. Acta Crystallogr. D-Struktur. Biol. 74, 519–530 (2018).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Goddard, TD et al. UCSF ChimeraX: Moderne Herausforderungen in der Visualisierung und Analyse meistern. Proteinwissenschaft. 27, 14–25 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Robert, X. & Gouet, P. Entschlüsselung wichtiger Merkmale in Proteinstrukturen mit dem neuen ENDscript-Server. Nukleinsäuren Res. 42, W320–W324 (2014).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Aksyuk, AA et al. Strukturelle Erhaltung der Proteinfalte der Myoviridae-Phagenschwanzhülle. Struktur 19, 1885–1894 (2011).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Zheng, W. et al. Verfeinerte Kryo-EM-Struktur des T4-Endrohrs: Erkundung der niedrigsten Dosisgrenze. Struktur 25, 1436–1441.e2 (2017).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Ge, P. et al. Atomare Strukturen einer bakteriziden kontraktilen Nanoröhre im Zustand vor und nach der Kontraktion. Nat. Struktur. Mol. Biol. 22, 377–382 (2015).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Heymann, JB et al. Dreidimensionale Struktur des Toxin-Transportpartikel-Antifeeding-Prophagen von Serratia entomophila. J. Biol. Chem. 288, 25276–25284 (2013).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Clemens, DL, Ge, P., Lee, B.-Y., Horwitz, MA & Zhou, ZH Die Atomstruktur von T6SS zeigt verschachtelte Anordnungen, die für die Funktion wesentlich sind. Zelle 160, 940–951 (2015).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Kudryashev, M. et al. Struktur der kontraktilen Hülle des Typ-VI-Sekretionssystems. Zelle 160, 952–962 (2015).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Maghsoodi, A., Chatterjee, A., Andricioaei, I. & Perkins, NC Wie die Injektionsmaschinerie des Phagen T4 funktioniert, einschließlich Energie, Kräfte und dynamischer Weg. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 116, 25097–25105 (2019).

Artikel CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Leiman, PG & Shneider, MM Kontraktile Schwanzmaschinen von Bakteriophagen. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 93–114 (2012).

King, J. & Mykolajewyoz, N. Schwanzanordnung des Bakteriophagen T4: Proteine ​​der Hülle, des Kerns und der Grundplatte. J. Mol. Biol. 75, 339–358 (1973).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kremer, JR, Mastronarde, DN & McIntosh, JR Computervisualisierung dreidimensionaler Bilddaten mit IMOD. J. Struktur. Biol. 116, 71–76 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pelt, DM Dmpelt/Jumbo-Bakteriophage: Erstveröffentlichung (v1.0.0). https://doi.org/10.5281/zenodo.7277351 (2022).

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Einfaches Suchwerkzeug für die lokale Ausrichtung. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kelley, LA, Mezulis, S., Yates, CM, Wass, MN & Sternberg, MJ Das Phyre2-Webportal für Proteinmodellierung, -vorhersage und -analyse. Nat. Protokoll. 10, 845–858 (2015).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Baek, M. et al. Genaue Vorhersage von Proteinstrukturen und -interaktionen mithilfe eines dreispurigen neuronalen Netzwerks. Wissenschaft 373, 871–876 (2021).

Artikel CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Weigele, PR, Scanlon, E. & King, J. Homotrimere, β-strängige virale Adhäsine und Schwanzproteine. J. Bakteriol. 185, 4022–4030 (2003).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Yan, J., Mao, J. & Xie, J. Bakteriophagen-Polysaccharid-Depolymerasen und biomedizinische Anwendungen. BioDrugs 28, 265–274 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schwarzer, D. et al. Ein multivalenter Adsorptionsapparat erklärt das breite Wirtsspektrum des Phagen phi92: eine umfassende genomische und strukturelle Analyse. J. Virol. 86, 10384–10398 (2012).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Cornelissen, A. et al. Der T7-verwandte Pseudomonas putida-Phage φ15 weist Virion-assoziierte Biofilm-Abbaueigenschaften auf. PloS One 6, e18597 (2011).

Artikel CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Latka, A., Maciejewska, B., Majkowska-Skrobek, G., Briers, Y. & Drulis-Kawa, Z. Bakteriophagen-kodierte Virion-assoziierte Enzyme zur Überwindung der Kohlenhydratbarrieren während des Infektionsprozesses. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 101, 3103–3119 (2017).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Seul, A. et al. Bakteriophagen-P22-Tailspike: Struktur des gesamten Proteins und Funktion des Interdomänen-Linkers. Acta Crystallogr. D Biol. Kristalllogr. 70, 1336–1345 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Prokhorov, NS et al. Funktion des Esterase-Tailspike des Bakteriophagen G7C bei der Adsorption von Wirtszellen. Mol. Mikrobiol. 105, 385–398 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Plattner, M. et al. Struktur und Funktion des verzweigten Rezeptor-Bindungskomplexes des Bakteriophagen CBA120. J. Mol. Biol. 431, 3718–3739 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zimmermann, L. et al. Ein komplett neu implementiertes MPI-Bioinformatik-Toolkit mit einem neuen HHpred-Server als Herzstück. J. Mol. Biol. 430, 2237–2243 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jacques, DA et al. HIV-1 nutzt dynamische Kapsidporen, um Nukleotide zu importieren und die Synthese eingekapselter DNA voranzutreiben. Natur 536, 349–353 (2016).

Artikel CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Leiman, PG et al. Der Sekretionsapparat vom Typ VI und Phagenschwanz-assoziierte Proteinkomplexe haben einen gemeinsamen evolutionären Ursprung. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 106, 4154–4159 (2009).

Artikel CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Records, AR Das Typ-VI-Sekretionssystem: ein Mehrzweckabgabesystem mit einer phagenähnlichen Maschinerie. Mol. Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. 24, 751–757 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Basler, M. Typ-VI-Sekretionssystem: Sekretion durch eine kontraktile Nanomaschine. Philos. Trans. R. Soc. B: Biol. Wissenschaft. 370, 20150021 (2015).

Artikel Google Scholar

Pelt, DM & Sethian, JA Ein dichtes Faltungs-Neuronales Netzwerk mit gemischtem Maßstab für die Bildanalyse. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 115, 254–259 (2018).

Artikel MathSciNet CAS ADS PubMed Google Scholar

Finn, RD, Clements, J. & Eddy, SR HMMER-Webserver: interaktive Sequenzähnlichkeitssuche. Nukleinsäuren Res. 39, W29–W37 (2011).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Gabler, F. et al. Proteinsequenzanalyse mit dem MPI-Bioinformatik-Toolkit. Curr. Protokoll. Bioinformatik 72, e108 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mastronarde, DN Automatisierte Elektronenmikroskop-Tomographie mit robuster Vorhersage von Probenbewegungen. J. Struktur. Biol. 152, 36–51 (2005).

Artikel PubMed Google Scholar

Hagen, WJ, Wan, W. & Briggs, JA Implementierung eines Neigungsschemas für die Kryo-Elektronentomographie, optimiert für die Mittelung hochauflösender Subtomogramme. J. Struktur. Biol. 197, 191–198 (2017).

Artikel PubMed Central PubMed Google Scholar

Schindelin, J. et al. Fidschi: eine Open-Source-Plattform für die Analyse biologischer Bilder. Nat. Methoden 9, 676–682 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: Anisotrope Korrektur der strahlinduzierten Bewegung für eine verbesserte Kryo-Elektronenmikroskopie. Nat. Methoden 14, 331–332 (2017).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: Schnelle und genaue Defokusschätzung aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen. J. Struktur. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artikel PubMed Central PubMed Google Scholar

Russo, CJ & Henderson, R. Ewald Kugelkorrektur mit einem Einseitenband-Bildverarbeitungsalgorithmus. Ultramicroscopy 187, 26–33 (2018).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Kucukelbir, A., Sigworth, FJ & Tagare, HD Quantifizierung der lokalen Auflösung von Kryo-EM-Dichtekarten. Nat. Methoden 11, 63–65 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589 (2021).

Artikel CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Singharoy, A. et al. Auf Molekulardynamik basierende Verfeinerung und Validierung für Kryo-Elektronenmikroskopiekarten unter 5 Å. Elife 5, e16105 (2016).

Artikel PubMed Central PubMed Google Scholar

Phillips, JC et al. Skalierbare Molekulardynamik mit NAMD. J. Comput. Chem. 26, 1781–1802 (2005).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Huang, L. & Roux, B. Automatisierte Kraftfeldparametrisierung für nichtpolarisierbare und polarisierbare Atommodelle basierend auf Ab-initio-Zieldaten. J. Chem. Theorieberechnung. 9, 3543–3556 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: visuelle Molekulardynamik. J. Mol. Graph. 14, 33–38 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Afonine, PV et al. Realraumverfeinerung in PHENIX für Kryo-EM und Kristallographie. Acta Crystallogr. Sekte. D: Struktur. Biol. 74, 531–544 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Potter, SC et al. HMMER-Webserver: Update 2018. Nukleinsäuren Res. 46, W200–W204 (2018).

Artikel CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Pelt, DM, Batenburg, KJ & Sethian, JA Verbesserung der tomografischen Rekonstruktion aus begrenzten Daten mithilfe dichter Faltungs-Neuronalnetze im gemischten Maßstab. J. Imaging 4, 128 (2018).

Artikel Google Scholar

Segev-Zarko, L.-a. et al. Kryo-Elektronentomographie mit dichten neuronalen Netzwerken unterschiedlicher Größenordnung enthüllt wichtige Schritte beim Einsatz von Toxoplasma-Invasionsmaschinen. PNAS Nexus 1, pgac183(2022).

Kingma, DP & Ba, J. Adam: eine Methode zur stochastischen Optimierung. https://arxiv.org/abs/1412.6980 (2014).

Ahrens, J., Geveci, B. & Law, C. Paraview: ein Endbenutzer-Tool für die Visualisierung großer Datenmengen. Das Visualisierungshandbuch 717 (2005).

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit ist Teil des Forschungsprogramms National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure 2017–2018 mit der Projektnummer 184.034.014, das teilweise vom niederländischen Forschungsrat (NWO) finanziert wird. CKC und PJS werden von BBSRC, MRC und Wellcome finanziert. Die Depolymerase-Experimente und -Analysen wurden vom Nationalen Wissenschaftszentrum Polen mit den Fördernummern UMO-2017/26/M/NZ1/00233 an ZD-K., AL und UMO-2020/38/E/NZ8/00432 an AOAL unterstützt ist Inhaber eines Junior-Postdoktorandenstipendiums der Forschungsstiftung Flandern (FWO) mit der Fördernummer 1240021. NDMP wird von der NWO mit der Fördernummer 016.Veni.192.235 unterstützt. SJJB wird von der NWO mit dem VICI-Zuschuss VI.C.182.027 und dem European Research Council (ERC) CoG mit der Zuschuss-Nr. unterstützt. 101003229. RO wurde vom China Scholarship Council (CSC) mit der Projektnummer 201906280465 unterstützt. Wir danken Jamie Depelteau und Adam Sidi Mabrouk für die Hilfe bei der Kryo-EM-Probenvorbereitung; Wen Yang und Willem Noteborn für die Kryo-EM-Datenerfassung; Ludovic Renault und Frédéric Bonnet für Hilfe bei der Kryo-EM-Datenverarbeitung; Boris Estrada-Bonilla für technische Unterstützung; Xiao Zhang für Hilfe bei der Extraktion der Netzwerkergebnisse und Lei Zhang für kritisches Feedback zum Manuskript. Die in dieser Studie verwendeten K. pneumoniae-Referenzstämme (CIP-markierte Stämme) wurden von der Collection de l'Institut Pasteur (CIP, Paris, Frankreich) bezogen.

MOE Key Laboratory for Nonequilibrium Synthesis and Modulation of Condensed Matter, School of Physics, Xi'an Jiaotong University, Xianning West Road 28, Xi'an, 710049, China

Ruochen Ouyang

Abteilung für Mikrobielle Wissenschaften, Institut für Biologie, Universität Leiden, Sylviusweg 72, 2333 BE, Leiden, Niederlande

Ruochen Ouyang, Vera CJ Williams & Ariane Briegel

Abteilung für Bionanowissenschaften, Technische Universität Delft, Van der Maasweg 9, 2629 HZ, Delft, Niederlande

Ana Rita Costa und Stan JJ Brouns

Kavli Institute of Nanoscience, Delft, Niederlande

Ana Rita Costa und Stan JJ Brouns

Abteilung für Biochemie, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

C. Keith Cassidy

Abteilung für Pathogenbiologie und Immunologie, Universität Breslau, Przybyszewskiego 63-77, 51-148, Breslau, Polen

Aleksandra Otwinowska, Agnieszka Latka und Zuzanna Drulis-Kawa

Abteilung für Biotechnologie, Universität Gent, Valentin Vaerwyckweg 1, 9000, Gent, Belgien

Agnieszka Latka & Yves Briers

School of Life Sciences & Department of Chemistry, University of Warwick, Coventry, CV4 7AL, Großbritannien

Phill J. Stansfeld

Leiden Institute of Advanced Computer Science, Universität Leiden, Niels Bohrweg 1, 2333CA, Leiden, Niederlande

Daniel M. Pelt

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Konzeptualisierung: AB, SJJB, YB, ZDK; Methodik: AB, RO, YB, ZDK, CKC; Software: RO, CKC; formale Analyse: RO, CKC, DMP, AL, AO, VW; Untersuchung: RO, ARC, CKC, AO; Ressourcen: AB, SJJB, DMP, YB, ZDK; Datenkuration: RO, AB, YB, ZDK; Schreiben des Originalentwurfs: RO, AB, YB, DMP, ZDK; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten von RO, ARC, CKC, VW, PJS, DMP, SJJ, YB, AL, ZDK, AO; Visualisierung: RO, VW, YB; Aufsicht: AB, SJJB, YB, ZDK; Projektleitung: AB; Finanzierungsakquise: AB, SJJB, CKC, PJS, ZDK, AL, DMP, OR

Korrespondenz mit Ariane Briegel.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Guy Schoehn und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ouyang, R., Costa, AR, Cassidy, CK et al. Hochauflösende Rekonstruktion eines Jumbo-Bakteriophagen, der verkapselte Bakterien mithilfe hyperverzweigter Schwanzfasern infiziert. Nat Commun 13, 7241 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34972-5

Zitat herunterladen

Eingegangen: 13. April 2022

Angenommen: 14. November 2022

Veröffentlicht: 24. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34972-5

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.